审评四部     张明平

    保证产品无菌是注射剂产品质量保证的核心问题。无菌生产工艺是保障注射剂产品无菌的关键手段。而只有经过充分验证后的灭菌（无菌）生产工艺，才能保证生产出无菌的产品。微生物挑战试验是无菌生产工艺验证的重要环节。而选择适当的生物指示剂则是微生物挑战试验结果获得认可的关键。本文将围绕如何为终端灭菌工艺（过度杀灭和残存概率法）选择适当的生物指示剂进行讨论。

    灭菌是指杀灭所有形式微生物的过程。在业界，常用“无菌保证水平”（Sterility Assurance Level,SAL）概念来评价灭菌（无菌）工艺的效果，SAL的定义为产品经灭菌/除菌后微生物残存的概率。该值越小，表明产品中微生物存在的概率越小。为了保证注射剂的无菌安全性，G际上一致规定，采用湿热灭菌法的SAL不得大于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一。生物指示剂就是为了保证整个灭菌过程达到SAL 水平而应用的,它能综合反映影响灭菌效果的各种因素。因此为了保证验证结果的重复性，生物指示剂应当采用标准化的菌株（即变异性小，各项生物学特征均一性好的菌种），并且应当具备合乎要求的抗力。更重要的是，参照USP的要求“It must be established that the biological indicator system provides a challenge to the sterilization process that exceeds the challenge of the natural microbial burden in or on the product.”，我们应当选择比现有生产线自然环境下所发现的菌株更难杀灭的菌株来作为生物指示剂。举例来说，比如通过对现有车间环境、生产线、人员、物料两年的的连续观测，发现在现有生产条件下所发现的菌株的D值**高不超过0.8，则选择D值在0.8～1.5之间的生孢梭菌( Clostridium sporogenes；ATCC7955)为生物指示剂进行验证就是不合适的。而如果在现有生产条件下所发现的菌株的D值**高不超过0.6，则可以选择生孢梭菌为生物指示剂。

    只要满足以上两个原则（标准化菌株及合乎要求的抗力），生产企业可以自行选择、研究、培养生物指示剂（前提是提供充分的生产环境和验证菌株的研究资料）；也可以选择商用的生物指示剂产品，如Bacillus stearothermophilus（嗜热脂肪芽孢杆菌）、Clostridium Sporogenes（生孢梭菌）、Bacillus subtilis （枯草芽孢杆菌）、Bacillus coagulans（凝结芽孢杆菌）等菌种的孢子。不论采用何种验证菌株，参照USP，对湿热灭菌（121℃）的工艺验证用菌株均应证明“具备合乎要求的抗力”；通常应满足以下要求：D值在1.5～3.0之间；存活时间在4.5～14.0min之间；完全杀灭时间在13.5～32.0min之间。为了表征菌株的“抗力”，可参照USP<55> BIOLOGICAL INDICATORS—RESISTANCE PERFORMANCE TESTS的相关标准化程序，测定D值、存活时间和杀灭时间，并提交相关的验证资料。

    但在大多数情况下，在申报新药时G内企业缺乏对车间环境、生产线、人员、物料连续两年的检测资料。在这种情况下企业不能自行选择“新”的生物指示剂，而应当选择为目前业界熟知的一些生物指示剂。目前，嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(ATCC 7953)已成为验证湿热灭菌程序的**常用的生物指示剂。采用该菌株进行灭菌工艺验证通常不再需要企业提供连续两年的微生物环境监测结果。

    验证过程通常为将一定量已知耐热性的孢子接入产品中, 用设定的灭菌程序灭菌, 以确认设定的灭菌工艺是否符合标准。然而有的产品可能会增加微生物的耐热性, 有的产品可能会杀灭微生物或与之不相容, 在后一种情况下, 可考虑用生理盐水或与产品相似的溶液替代产品进行验证试验。所以研究灭菌程序之前, 必须了解生物指示剂在产品或替代产品中的耐热性。即参照USP<55>的要求对D值进行测定。其中规定“The requirements of the test are met if the determined D value is within 20% of the labeled D value for the selected sterilizing temperature and if the confidence limits of the estimate are within 10% of the determined D value.”。即测定的D值应该为标定值的80～120%（置信区间为10%以内）。此外，企业有责任对购买的指示剂产品的纯度和分类学特征进行研究，**少应当确定该微生物的“种”；并详细说明供应商提供的菌种的D值范围、适用的灭菌条件、存储条件、出厂时间、过期时间、菌种稳定性等资料。当该生物指示剂存储时间较长或者拟进行验证的灭菌条件与生产商的说明不符时，必须重新测定指示剂的D值、存活时间和杀灭时间。

    在使用生物指示剂时容易忽视的一点就是——所有关于满足SAL不得大于10-6的产品就是无菌产品的假设都是建立在原产品中的微生物量（bioburden，生物负荷）不超过每单位壹佰万个。因此应当检测生物指示剂每个单剂量中的微生物孢子数。参照USP要求“The requirements of the test are met if the average number of viable spores per carrier is not less than 0.3 log of the labeled spore count per carrier and does not exceed the log labeled spore count per carrier by 0.48.”；即单剂量包装中的孢子数不低于标示量的0.3Log，亦不得过标示量的0.48Log。

    总而言之，选择恰当的生物指示剂，执行正确的步骤，并提供系统完整的信息，才能使无菌生产工艺验证结果令人信服。

【参考文献】
1、USP28；
2、姚楚水，姚达远，李荣芬；嗜热脂肪杆菌芽胞恢复培养基的研究；中G消毒学杂志, 1995年 01期；
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5、熊海元；嗜热脂肪芽孢杆菌孢子在四种介质中的耐热性平；中G医药工业杂志2002, 33 (4)；
6、黄靖雄；生物监测方法的选择；中华医院感染学杂志2004，14（8）；
7、注射剂无菌保证工艺研究及评价的原则要求，药品审评中心；